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GRAVITATIONSBIOLOGIE

Forschung im Weltraum und auf der Erde

"Frühe Prozesse der Schwerkraftwahrnehmung im Modellsystem Chara und in Höheren Pflanzen - Untersuchungen in Mikrogravitation und auf der Erde" gefördert von BMBF durch DLR

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Institut für Molekulare Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen

 

"Molekulare und strukturelle Grundlagen des Schwerkraft-orientierten Spitzenwachstums"

Foto Christoph Limbach

Dipl. Biol. Christoph Limbach

Telefon: +49-(0)228-73-2686

e-mail: climbach@uni-bonn.de

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Seit Beginn der Untersuchungen zum Schwerkraft-orientierten Wachstum (Gravitropismus) der Pflanzen zu Beginn des 20. Jahrhunderts standen die zellulären Prozesse der gravitropen Signaltransduktion im Mittelpunkt des Interesses. Trotz des Fortschrittes im molekularbiologischen Methodenbereich liegen die genetischen Grundlagen dieser Prozesse bis heute noch völlig im Dunkeln, da die Schwerkraft-wahrnehmenden Zellen (vor allem bei Höheren Pflanzen) oftmals nur schwer zugänglich sind und zelluläre Mechanismen der Signalverarbeitung nicht immer eindeutig der Schwerkraftwahrnehmung zugeordnet werden können. Außerdem fehlen nach wie vor systematische ultrastrukturelle Untersuchungen, die Aufschluss über die funktionalen Zusammenhänge der identifizierten Zellorganellen und -strukturen beim Gravitropismus geben können.

Die positiv bzw. negativ gravitrop wachsenden Rhizoide und Protonemata der Grünalge Chara sind nicht nur ausgezeichnete Modellsysteme für zellbiologische Untersuchungen, sie eignen sich wegen ihres Einzell-Charakters insbesondere auch für molekulargenetische Analysen von Schlüsselkomponenten der gravitropen Signalketten und für elektronenmikroskopische Ultrastrukturuntersuchungen der Zellspitze, in der die entscheidenden Teilprozesse des gravitropen Wachstums auf engstem Raum stattfinden.

 

Analyse Schwerkraft-modulierter Genexpressionsmuster durch
DIFFERENTIAL DISPLAY

Durch die Analyse von Genexpressionsmustern im Chara-Rhizoid sollen solche Gene identifiziert und charakterisiert werden, deren jeweilige Funktion durch eine zeitlich veränderte Expression im Verlauf der Gravireaktion reguliert wird. Durch den Vergleich von Rhizoiden und Protonemata sollen außerdem solche Komponenten der Signalketten identifiziert werden, die bei der positiv bzw. negativ gravitropen Orientierung eine Schlüsselfunktion einnehmen. Die große morphologische und funktionale Ähnlichkeit der beiden Zelltypen lässt vermuten, dass sie sich nur durch die differenzielle Expression einer relativ überschaubaren Anzahl von Genen unterscheiden.

Um Unterschiede in den Genexpressionsmustern festzustellen, wird zunächst mRNA aus den Vergleichssystemen isoliert und durch Reverse Transkription in cDNA umgeschrieben. Mittels "Random Primed PCR" werden zufällige Fragmente der verschiedenen cDNAs amplifiziert und kapillarelektrophoretisch aufgetrennt. Durch den Vergleich der Expressionsmuster können differenziell exprimierte Fragmente identifiziert  und anschließend sequenziert werden. Die vollständige Sequenz der entsprechenden Gene wird dann durch RACE-PCR ermittelt und mit den Einträgen in Gendatenbanken verglichen, um Informationen über Struktur und mögliche Funktion des zugehörigen Proteins zu erhalten.

 

Kapillarelektrophoretische Fragmentanalyse nach Random Primed PCR in unstimulierten (blau) und gravistimulierten (grün) Rhizoiden

 

 

Elektronenmikroskopische Untersuchungen der strukturellen und funktionalen Grundlagen des gravitropen Spitzenwachstums

Die strukturellen Eigenschaften und die funktionalen Beziehungen der Zellkomponenten bilden die Grundlage für jegliche Signalverarbeitung in der Zelle. Durch verschiedene zellbiologische Methoden konnten zahlreiche Proteine identifiziert und lokalisiert werden, die an der Regulation und Steuerung des Schwerkraft-orientierten Wachstums in Rhizoiden und Protonemata beteiligt sind. Der funktionale Zusammenhang untereinander und im Zusammenspiel mit den wichtigen strukturellen Zellbestandteilen ist jedoch weitgehend unklar.

Deshalb wird in Kooperation mit Prof. Andrew Staehelin von der University of Colorado in Boulder, USA ein Projekt zur systematischen elektronenmikroskopischen Ultrastrukturanalyse des Chara-Rhizoids durchgeführt. Die im Labor von Prof. Staehelin etablierte Technik der Hochdruckeinfrierfixierung (High-Pressure Freeze Fixation mit Baltec HPM010) ist die derzeit beste Variante der Gefrierfixierung, welche im Vergleich zur chemischen Fixierung das Auftreten gravierender Fixierungsartefakte weitgehend vermeidet und deutlich bessere Ergebnisse bei der Ultrastrukturerhaltung liefert. Der Wachstumsbereich der Zelle in der Spitze des Rhizoids wird mit Hilfe einer innovativen, computer-gesteuerten EM-Technologie, der hoch auflösenden 3D-Tomographie (dual axis, high voltage electron microscope tomography, Mastronarde 1997) analysiert. An einem Hochspannungs-Elektronenmikroskop (siehe Bild) werden Bildserien unter veränderlichen Neigungswinkeln eines Schnittes aufgenommen. Das an der University of Colorado entwickelte Software-Paket IMOD verrechnet diese Bildserien und rekonstruiert ein dreidimensionales Tomogramm des Präparates. Dadurch wird die Auflösungsgrenze im Vergleich zur konventionellen Elektronenmikroskopie erheblich reduziert. Das Computerprogramm ermöglicht schließlich die dreidimensionale Modellierung subzellulärer Strukturen in tomografischen Schnittserien und somit eine modellhafte, anschauliche und übersichtliche Darstellung struktureller Details.

Im Vergleich zur chemischen Fixierung liefert die Gefrierfixierung eine deutliche verbesserte Erhaltung von Proteinepitopen und ist deshalb auch für elektronenmikroskopische Lokalisationsmethoden (Immunogoldlokalisation) sehr viel besser geeignet. Durch den Einsatz spezifischer Antikörper werden strukturelle und regulatorische Proteine, die für die Mechanismen des gravitropen Spitzenwachstums wichtig sind, in der Zelle präzise lokalisiert, um Aufschluss über molekulare Interaktionen und funktionale Zusammenhänge zu erhalten.

Tecnai F30

3D Modell

Tecnai F30 Hochspannungs-Elektronenmikroskop der CU Boulder

3D Modell aus dem Bereich der apikalen Plasmamembran eines Rhzoids mit verschiedenen Vesikeltypen.