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GRAVITATIONSBIOLOGIE

Forschung im Weltraum und auf der Erde

"Frühe Prozesse der Schwerkraftwahrnehmung im Modellsystem Chara und in Höheren Pflanzen - Untersuchungen in Mikrogravitation und auf der Erde" gefördert von BMBF durch DLR

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Institut für Molekulare Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen

 

Diplomarbeit:

"Isolierung und molekulare Charakterisierung Spektrin-artiger Proteine der Grünalge Chara"

Foto Andreas Kutscheidt

Andreas Kutscheidt

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Während des polaren Spitzenwachstums einer Pflanzenzelle ist es wichtig, daß der Membrankomplex des Spitzenkörpers stabilisiert wird. In roten Blutkörperchen wird diese Aufgabe von Proteinen übernommen, die als Spektrine bekannt sind. Man unterscheidet zwischen alpha - und beta Spektrinen. Diese Proteine, die aus Wiederholungen eines 106 Aminosäuren langen Spektrin-Motivs aufgebaut sind, bilden jeweils Dimere und lagern sich dann zu einem Tetramer zusammen. Aufgrund immuncytochemischer Experimente gibt es Hinweise darauf daß spektrin-artige Proteine auch im Spitzenkörper von Chara-Rhizoiden während der Wachstumsphase auftreten.

Schema Spektrin

Die vorliegende Diplomarbeit wurde im Zeitraum von Juli 2001 - April 2002 verfasst.

Zusammenfassung

Im Zusammenhang mit Aktin-bindenden Proteinen wurden vor kurzem durch immunzytochemische Versuche Spektrin-artige Proteine in verschiedenen Pflanzenspezies und Zelltypen gefunden. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die im Spitzenkörper von Rhizoiden der Grünalge Chara globularis nachgewiesenen Epitope Spektrin-artiger Proteine mit Hilfe molekularbiologischer Methoden nachzuweisen und zu charakterisieren. Informationen über den genauen Aufbau dieser Proteine könnten neue Impulse bei der Erforschung des Mechanismus des gravitropen Spitzenwachstums liefern. Die Experimente wurden außerdem auf das weit verbreitete Modellsystem Arabidopsis thaliana und auf ebenfalls spitzenwachsende Zellen des Laubmooses Physcomitrella patens ausgedehnt.

Die Anzucht des für die Experimente verwendeten Pflanzenmaterials wurde dabei unter kontrollierten, möglichst sterilen Bedingungen durchgeführt. Frische Chara-Thalli konnten im Labor innerhalb von zwei Wochen erfolgreich herangezogen werden. Diese neue Kultur bietet die Möglichkeit, vom saisonalen Umfeld unabhängig, regelmäßig Material für neue Experimente zur Verfügung zu haben. Die aus dieser Kultur gewonnenen Zellen wurden hier nur zur Isolierung von DNS benutzt, da für zellbiologische Experimente auch Material aus herkömmlichen Quellen benutzt werden kann. Es gelang ebenfalls eine sterile Kultur von Physcomitrella patens aus Sporen heranzuziehen und zu propagieren. Die aus dieser Kultur gewonnenen Zellen eignen sich sowohl für molekularbiologische als auch zellbiologische Experimente.

Die Isolierung von DNS aus geringen Mengen Chara-Thalli und -Rhizoiden konnte mit Hilfe verschiedener Methoden erfolgreich durchgeführt werden. Aus Physcomitrella konnten große Mengen an DNS isoliert werden. Die aus diesen Isolierungen gewonnene DNS wurde als Matrize für PCR-Versuche eingesetzt, um bestimmte Abschnitte von Genen für Spektrin-artige Proteine zu amplifizieren. Dafür wurden im Vorfeld Sequenzen bereits bekannter Spektrin-Gene aus Mus musculus und Homo sapiens miteinander verglichen. Auf der Basis von Konsensus-Sequenzen homologer Abschnitte dieser Gene wurden Primer entworfen, die zur Durchmusterung der pflanzlichen Genome nach diesen Gen-Abschnitten eingesetzt wurden. Dabei wurden besonders die Abschnitte beachtet, die für Stellen in exprimierten Spektrinen kodieren, die Eigenschaften aufweisen, denen eine Rolle bei der Regulierung des Spitzenwachstum zukommen könnte, wie zB Bindungsstellen für die Proteine Aktin und Ankyrin, bei der Regulation des Kalzium-Gradienten beteiligte EF-Hände, am zellulären Signalprozess beteiligte SH3-Domänen, und nach dem, für die gesamte Superfamilie charakteristischen und namensgebenden Spektrin-Repeat. Als positive Kontrolle wurden die PCRs auch mit DNS aus Mäusen durchgeführt. Dabei gelang es nur aus den Versuchen für die Amplifikation der Gene der Ankyrin-Bindungsstelle auf dem ß-Spektrin definierte PCR-Produkte in zufriedenstellender Menge und Qualität zu erhalten. Bei den anderen PCRs zeigten sich teilweise Verunreinigungen oder Mehrfachbanden, oder die schwach nachweisbaren Amplifikate ließen sich nicht in für eine weitere Verarbeitung ausreichender Quantität herstellen.

Die PCR-Produkte, die qualitativ und quantitativ zufriedenstellende Eigenschaften aufwiesen, wurden in Vektoren ligiert und in Bakterien transformiert. Aus den E. coli-Kulturen wurden die Klone ausgewählt, die das PCR-Produkt als Insert aufwiesen. Die aus diesen Zellen gewonnenen Plasmide wurden extrahiert und zur Sequenzierung des Inserts eingesetzt. Die entsprechenden Sequenzen wurden auf Ähnlichkeiten mit bekannten Genen durchsucht. Dabei konnte kein entscheidender Hinweis auf Gene für Teile Spektrin-artiger Proteine in Chara globularis und Arabidopsis thaliana erbracht werden. Die aus den PCRs zur Amplifikation des Genabschnitts für die Ankyrin-Bindungsstelle gewonnenen Sequenzen wiesen keine Ähnlichkeiten mit den erwarteten Sequenzen auf. Erschwerend kam hinzu, daß die gewonnenen Sequenzen auch untereinander nur geringe Ähnlichkeiten aufwiesen. Die in den weiteren PCR-Versuchen auftretenden Banden konnten meist nicht den erwarteten PCR-Produkten zugeordnet werden.

Es ließen sich letztlich keine gesicherten Aussagen über das Vorkommen und die Eigenschaften von Genen treffen, die für mögliche Spektrin-artige Proteine in den untersuchten Pflanzenspezies Arabidopsis thaliana, Chara globularis und Physcomitrella patens kodieren.

 

Die vollständige Diplomarbeit ist als PDF (Größe ca. 1.8 MB) verfügbar: